チラコイド膜における光化学系I(P-700)の定量

光化学系Iの反応中心量を定量しようと思った時、一番簡単なのは反応中心クロロフィルであるP-700の吸収変化により求める方法です。一般的にはP-700が光照射によって酸化される際の吸収変化を測定することになりますので、励起光照射ができる分光光度計が必要となります。しかし、吸収変化の大きさは比較的大きく、また、同じ波長領域に吸収変化を示す物質は多くないので、一度測定系ができあがれば、測定自体は極めて簡単です。ここでは、チラコイド膜ないしは光化学系I標品など溶液系での光酸化を用いた方法と、酸化還元試薬を利用した方法について、それぞれ紹介します。

  1. P-700とは
  2. P-700光酸化の測定
  3. P-700の化学的酸化還元の測定

P-700とは

光化学系Iの反応中心

酸素発生型の光合成には2つの光化学系、光化学系Iと光化学系IIがありますが、そのうち光化学系Iの反応中心として働いているのがP-700です。光化学系Iにおいて、アンテナクロロフィルが捕集した光エネルギーは反応中心であるP-700に集められ、結果として励起されたP-700は電子を初期電子受容体のA0に渡して、自身は酸化されます。これが光化学系Iにおける初期電荷分離です。A0に渡った電子は、光化学系Iの反応中心複合体内のA1, FX, FA/Bを経てストロマのフェレドキシンを還元します。酸化されたP-700の方は、チラコイド膜内腔のプラストシアニン(場合によってシトクロムc6)によって元の還元状態に戻ります。P-700の本体は、クロロフィルaとその立体異性体であるクロロフィルa'が二量体を形成したものです。当然のことながら、光化学系Iの複合体にP-700は1つ含まれることになりますから、P-700の定量をすれば、光化学系Iの量を知ることができます。

P-700の酸化還元差スペクトル

P-700の本体はクロロフィルですから、基本的には赤と青の領域に吸収を持ちます。ただし、二量体を形成しているため、その相互作用により赤い領域の吸収帯は長波長にシフトしています。従って、通常のクロロフィルが、生体内では670 nmから680 nm程度に吸収を示すのに対して、700 nm付近に吸収を示します。これが、P-700という名前の由来になっています。P-700が酸化されると、電子を失ってP-700+になりますが、このプラスの電荷は、2分子のクロロフィルの片方に偏っていると考えられます。つまり、還元型の二量体クロロフィルは、酸化に伴い、酸化されたクロロフィル(クロロフィルカチオン)とクロロフィルのペアに変化することになります。ということは、P-700の酸化に伴い、そのスペクトルにおいて、(1)二量体クロロフィルの吸収が減少する、(2)単量体クロロフィルの吸収が増加する、(3)クロロフィルカチオンの吸収が増加する、ことになります。具体的には、(1)により700 nm付近と435 nm付近の吸収が減少し、(2)によって690 nm付近の吸収が増加し、(3)によって800 nmより長波長の赤外領域の吸収が増加する、ということになります。従って、これらのどれかの吸収変化を測定すれば、P-700の酸化還元をモニターすることができることになりますが、たくさんあるアンテナクロロフィル吸収が大きい、435 nmや690 nmよりは、700 nmや赤外領域の吸収の方が測定しやすいので、通常は700 nm付近もしくは、860 nm付近の吸収変化を測定することになります。

P-700の数とクロロフィルの数の比

一般的な高等植物では反応中心とアンテナクロロフィルの数の比(アンテナサイズ)は光化学系Iでも光化学系IIでもおおざっぱに言って200程度になります。光化学系Iの場合は、いわゆる反応中心コアと呼ばれる部分に100程度のクロロフィル、LHCIというアンテナの部分にやはり100程度のクロロフィルが結合しています。P-700というのは、複合体に特別な形で配位したクロロフィルが本体ですから、クロロフィルを抽出してしまったら他のアンテナクロロフィルと一緒で区別が付きません。ただ、P-700の2分子のクロロフィルのうち片一方は、上に述べたようにクロロフィルa'ですから、これをHPLCなどでクロロフィルaと分離して定量することは可能です。このようにして光化学系I量を定量した例も実際にありますが、抽出してしまうとクロロフィルaとクロロフィルa'は相互に変換してしまうので、きちんとした定量結果を出すにはある程度の熟練が必要です。とすると、複合体に結合したままで測定することになりますが、その際に、例えば、700 nmで測定しようとしても、そこには1分子あたりでは小さいにせよ場合によって数百分子のアンテナクロロフィルの無視できない吸収があります。ただし、光によって酸化還元するのは反応中心であって、アンテナクロロフィルは酸化還元しませんから、酸化還元した際の吸収の変化に注目すれば、それはP-700の量を反映することになります。実際には、P-700が還元された状態で吸収を測っておき、次にP-700を酸化して、その際の吸収の変化を見ることになります。この際、全体の吸収に対するP-700の酸化による吸収変化の割合は極めて小さいので、元の吸収をなんらかの形で引き算しておく必要が生じます。そこさえうまくやれば、P-700の吸収変化を多くのアンテナクロロフィルの吸収から分離して測定できることになります。

P-700光酸化の測定

以下では、チラコイド膜などの溶液試料で横から試料をあてられるように改造した分光器を用いてP-700を測定する方法を示します。測定波長は通常700 nm付近なので、励起光照射時に出るクロロフィル蛍光が測定を妨害する可能性があり、試料室と光電子増倍管の距離を長く取れる分光器が適しています。435 nm付近で測定すれば、蛍光の妨害はなくなりますが、この波長領域では、P-700以外にも吸収変化を示すものがある可能性があるため、チラコイド膜などの測定の場合は、好まれません。

準備するもの

使用する光学フィルター類

試薬

測定試料の準備

  1. 1.5 mlのチューブに13.5 μg Chlorophyll (15 nmol)を含むチラコイド膜サンプルを加える。(以下、作業は氷上で行なう)
  2. 1% DMを20 μl加え、軽くボルテックスする(この段階で、一時的にDMが高濃度になることでチラコイド膜が可溶化する)。
  3. 50 mM Tris/HCl buffer (pH 7.5) を他の成分(1, 2, 4-7)を全て差し引いた分量、すなわち1000-59-(1.で加えたチラコイド膜サンプル量)(μl)加える。
  4. 0.5 M sodium ascorbateを20 μl加える。
  5. 20 mMのTMPDを4 μl加える。
  6. 2 mMのMVを5 μl加える。
  7. 1 mMのDCMUを10 μl加える(最後に加えるのは他へのコンタミを防ぐため)。
  8. 軽くボルテックスし、4℃, 15000 rpmで10 min遠心し、可溶化しないデンプンなどを沈殿させる。
  9. 氷容器にチューブを移しての蓋を閉め(遮光)、分光器の前に移動する。

通常の方法で単離した高等植物のチラコイド膜は、ある程度のプラストシアニンがチラコイド膜内腔に閉じこめられたままになっているので、DCMUを加えないと系IIからの電子伝達が早すぎて光を当ててもP-700を十分に酸化できない。シアノバクテリアののチラコイド膜は、単離の際にチトクロームc6をほとんど失っているため、DCMUを加えなくても系IIからの電子がP-700を還元することはなく、そのままで測定可能。また、シアノバクテリアの場合は系Iの相対量が多くアンテナクロロフィルは少ないため、測定に必要なクロロフィル量は3-10 nmolで十分である。この場合、TMPDの量も調節する必要がある。調節の仕方については最後の「サンプルの種類が変わった際に調整すること」を参照。

分光器(日立356)のチェックおよび光源準備第2試料室

  1. 必要に応じ第二資料室(右側の資料室)奥の採光窓をねじ蓋で閉じる。
  2. 必要に応じ、光電子増倍管を外し(光に当てないようにする)、保護フィルターを取り付ける(R-69および赤色干渉フィルター)。
  3. ステージを1セルタイプのものに交換する。
  4. マスクを向きに気をつけてはめてから、マスクを抑えるように光電子増倍管を固定する(※光電子増倍管の白線と、止め金具の白線を重ね合わせる)。
  5. サンプル室内にあるSPRIT/DUALの切り替えをDUAL(サンプル光とリファレンス光が光電子増倍管上の同じ面に入る)にする(※光電子増倍管の感面の違いによる差をなくすため)。
  6. SCANNINGのSELECTをλ1=λ2にして、λ2の波長設定窓を見ながら測定波長(700 nm)に合わせる(一度BACKで長波長側にしてから微調整する)。光電子増倍管にフィルタをつける
  7. SLITを4 nm (切り取れる波長幅)、1 mm (実際のモノクロメータースリットの幅)にセットする。
  8. HIGH VOLTAGEをAUTOにセットする。
  9. REFERENCE SIGNALはλ1にセットする。
  10. RESPONSE(時間応答)をF(fast)にセットする(Sの方がノイズは減るが、P700の吸収変化は高速の変化なのでFでみる)。日立356型分光光度計の各部
  11. RANGEをENERGY(高電圧がかかっていない状態)にする(電源を入れる時や測定をしていない時は常にここに合わせる)。
  12. 励起光のランプ電源を入れ、電圧をあげた時ランプがきちんとつくかどうかチェックする。また、ランプの高さや向きを調整し、サンプルフォルダー全体に光がきちんとあたっているかを紙などで確認する(CS 4-96を透過したサンプルフォルダー位置における光量子束密度は40 μmol m-2s-1であった)。

分光器の動作チェック

  1. 356のRANGEをENERGYにしている状態でPOWERをONにする(本体全面の赤いボタンを押す)。
  2. レコーダーのRANGEを10 mV 、モードをSERVOに合わせる。
  3. RANGEをT=100%にする(このときHIGH VOLTAGEのゲージをみて200 V前後になっていることを確認する)。※もし0になっていたら、蓋がきちんと閉じてないため安全装置が働いていないかチェックする。もし高すぎたら、光電子増倍管の接触不良、もしくはフィルターの組み合わせがおかしい、のいずれかを疑うこと。
  4. SHUTTERをλ2にセットし(サンプル光のシャッターが閉じる)、レコーダーの0を0点調節つまみにより合わせる。
  5. SHUTTERをopenにセットし、レコーダーの100をあわせる(最初は両方のoptical attenuator(スリットから出た光の量を調節する絞り)が全開の状態にして調整を始める。レコーダーの針が100を超えた時はλ2のoptical attenuatorを絞っていき、サンプル光量を減らすことで調整し、100に満たない時はλ1のoptical attenuatorを絞って調節する。ただし、 attenuatorのネジが外れやすいので無理に回さないこと。 )
  6. RANGEをA=1.0に変えてきちんとレコーダーのペンが0を示すことを確認する。
  7. 動作チェックが終わったら、RANGEをENERGYに戻しておく。両方のoptical attenuatorも全開の状態に戻す。

P-700光酸化量測定

  1. サンプルをセルにデカントで注いだあと、第一資料室(左側)の蓋を開け一番手前のフォルダーに光路長が1 cmになる向きにセルをセットする(この時次の測定サンプルを氷から出しておくとセルの結露を防ぐことができる)。
  2. 分光器のRANGEをΔA0.01(レコーダーのフルスケールが0.01になる)にセットする。
  3. ペンレコーダーのスイッチをSERVOにし、λ1(reference)側のoptical attenuatorを調節して、ペンレコーダーの可動範囲にベースラインがくるようにする。ペンを下ろす。
  4. 手動シャッター(銀紙で包まれた厚紙)をランプと水フィルターの間に挟み、その状態で励起光をONにする。
  5. レコーダーをCHART(60 mm/minのスピードが適当)にする。
  6. ベースラインが落ち着いた適当なところで手動シャッターを素早く持ち上げ、サンプルに光を照射し、P700を光酸化させる(レコーダーが20-30目盛りほど動く)。
  7. チャート紙の線から線を目安に、適当な所で手動シャッターを下ろす。
  8. 6-7を3回ほど繰り返す。
  9. 測定が終了したら、レコーダーをAMPにして止め、ペンを持ち上げる。
  10. 励起光ランプ電源の電圧を0に下げてから、スイッチをOFFにする。
  11. RANGEをENERGYに戻してから、サンプル室の蓋を開けてセルを取り出す。
  12. サンプルをセルからデカントで回収し、セルはキムワイプの上に逆さまに立てて余分な水分を吸い取る。
  13. 次の次のサンプルを常温においてから、あらかじめ常温においてあるサンプルで測定を続ける。
  14. 全測定が終了したらRANGEがENERGYになっていることを確認してPOWERをOFFにする(もう一度赤いボタンを押せば良い)。

データ解析

酸化状態のP-700(明)と還元状態のP-700(暗)の701 nmにおける吸光度の差が、P-700の光酸化量に相当する(※通常P-700の光酸化速度は非常に速いが、暗還元速度は遅いので光酸化量の最大値を得るには、光照射直後の吸光度変化を用いる)。データにノイズがあるので、光を照射する直前のノイズの中点から、光を照射した直後のノイズの中点までを吸光度変化とする。このプロトコルの条件で測定したのは、15 μM Chlorophyllのサンプル中のP-700(ミリモル分子吸光係数= 63 mM-1cm-1、末尾の参考文献参照)の吸光度であるから、レンジ(ΔA=0.01)を考慮すると、サンプルに含まれるP-700の濃度(mM)およびP-700のアンテナサイズChl/P-700はそれぞれ以下のように計算できる。

P-700 (mM) = 0.01×目盛り数/100/63
Chl/P-700 = 15 [μM]/(1000×P-700 [mM])

右図の例(キュウリチラコイド膜)の場合、P-700 (mM) = 3.57×10-5、Chl/P-700 = 433 と計算できる。

サンプルの種類が変わった際に調整すること

1.スリット幅

P700の吸収帯は同時にクロロフィル蛍光の発光帯でもあるため、蛍光の寄与があると吸光度は見かけ上減少してしまう。そのため、スリットの幅を大きくし入射光を増加することにより相対的に蛍光によるノイズを減らすことができる(※直線的に進むの測定光に対し、蛍光はサンプルから全方向に放射状に発せられるため、サンプルフォルダーと光電子増倍管の距離を遠ざけることにより蛍光による妨害を本測定法では減らしているが、それだけでは十分ではない)。逆に、スリットを広げすぎると、特に吸収帯の幅が狭い場合、吸収変化をしていない波長領域をも含めて平均することになり、シグナルは小さくなる。

2.TMPD(P-700への電子供与体:P700の還元を促進する)の量

スリットの幅を大きくした場合、当然、入射光(測定光)が強くなる。測定光が強すぎると、励起光を照射する前にP-700が酸化されてしまう。結果として、P-700の吸収変化は真の値よりも低く見積もられてしまう(暗所で一部のP-700があらかじめ酸化されているため)。そこで、最大のシグナルを得られるまでTMPDの量を増加する。(※ただし必要量以上に加えると今度は励起光を照射した時にも十分な光酸化が起こらず、結果として再び吸収変化が小さくなる)

3.MV(光化学系Iの電子受容体:鉄イオウクラスタから電子を受け取る)の量

MVは、濃度が十分低い(1-3 μM)場合にはFA/FBからのみ電子を受け取るが、より高濃度の場合(>1 mM)はFxやA,Aからも電子を受け取ることができる。光化学系Iの電子伝達鎖が無傷の場合、このプロトコル通りの10 μMで測定しても、より高濃度の10 mMで測定してもシグナルの大きさに差はみられない。しかし、仮にFA/FBが損傷していると、10 mMに比べて10 μMの時のほうがシグナルは小さくなる。つまり、10 μMと10 mMにおけるP-700光酸化量の差を調べることでPSIの電子伝達鎖の阻害状態を推測できる。

4.励起光の強さと色

クロロフィル蛍光の強さは励起光の強さに比例するが、P700の酸化は、ある励起光強度において飽和する。従って、クロロフィル蛍光による妨害が観察される場合、励起光はP700の光酸化がぎりぎり飽和する強さであることが望ましい。また、室温でのクロロフィル蛍光は、ほとんどが光化学系2に由来するので、シアノバクテリアなどのフィコビリンをアンテナ色素として持つ材料の場合は、励起光を通すフィルターに、CS 4-96に加えて東芝の色ガラスフィルタV-42を重ねると、フィコビリンの励起が減るために蛍光による妨害が減る。

参考文献

  1. Terashima I, Funayama S and Sonoike K (1994) Planta 193: 300-306 (このプロトコールの測定方法)
  2. Sonoike K and Katoh S (1990) Plant Cell Physiol 31: 1079-1082 (P-700の差分子吸光係数)

P-700の化学的酸化還元の測定

上記の光酸化による測定においては、光照射によってP-700を酸化していますが、この酸化還元反応自体は一般的な酸化剤、還元剤を用いることによって化学的も起こります。従って、酸化還元試薬の添加の前後の吸収を測定することによっても、P-700の定量は可能です。ただし、光の照射の場合は、照射前後で試料の状態やセルの位置などが全く同一ですから、測定誤差をかなり少なくすることができるのに対して、化学的な酸化還元の場合は、酸化還元試薬を試料に加える際にどうしても誤差が生じますから、より高濃度の試料が必要になる欠点があります。一方で、光酸化の場合は、電子を受け取る電子受容体に異常がある場合は正確な定量ができません。電荷分離によってP-700が酸化しても、電子の行き場がない場合はP-700の再還元がすぐに起こり、光を照射してもP-700が完全に酸化されなくなるためです。化学的な酸化還元の場合は、電子受容体がどのような場合であれ、P-700自体が正常であれば、きちんと定量できる利点があります。また、通常の分光器だけで、光照射のシステムを必要としないことも利点でしょう。以下に化学的な酸化還元によるP-700の定量法を紹介します。

装置

普通にバックグラウンドの補正ができる分光器(研究室では古い日立の320型を用いているが別のものでも可)。

試薬

バッファー(50 mM Tris/HCl, pH7.5, 10 mM NaCl)、フェリシアン化カリウム(100 mM水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(1 M水溶液)、TMPD(1 M水溶液)、必要に応じてドデシルマルトシド(10%水溶液)

手順

チラコイド膜を高等植物の場合は40-50 μgChl/ml、シアノバクテリアの場合は10-20 μgChl/mlの最終濃度になるように5 mlのバッファーに懸濁する。ついで、最終濃度0.3 mMになるようにフェリシアン化カリウムを加えて混ぜ、そこから2つの同じ規格の分光セルに2 mlずつ分注する。セルを試料側と対象側にそれぞれおき、バックグラウンドの補正を行なう。ついで、まず、試料側のセルに22 μlの水を加えて混ぜる。ついで、対象側のセルに、アスコルビン酸ナトリウム溶液20 μlを加えて混ぜ、すぐにTMPD溶液2 μlを加えて混ぜ、750 nmから650 nmまでのスペクトルを測定する。

注意点

  1. フェリシアン化カリウムはアンテナクロロフィルも徐々に酸化してスペクトルに影響を与えるため、なるべく手早く測定する。ただし、アスコルビン酸を加えるまでは、試料側、対象側共にほぼ同じフェリシアン化カリウム濃度なので、影響は小さいはず。アスコルビン酸だけではなく、TMPDをも加えるのは還元を即座に完了させて、すぐに測定が開始できるようにするため。アスコルビン酸だけだと、P-700の完全還元に2−3分かかってしまう。
  2. TMPDは酸化型になると分解しやすい。従って、フェリシアン化カリウムの入っている試料にTMPDを直接入れることはせず、必ずアスコルビン酸を加えてから、TMPDを加える。アスコルビン酸とTMPDをあらかじめ混ぜた溶液を使ってもよいかも知れない。
  3. ノイズが大きい場合は、最初にドデシルマルトシドを加えてチラコイド膜を可溶化してから測定する。その場合は、最初のチラコイド膜の原液に最終濃度に換算して0.01%になるようにドデシルマルトシドを加える。例えば、チラコイド膜の原液が測定時の100倍の濃度であれば、原液に加えた時のドデシルマルトシド濃度は1%になる。このように一過的に高濃度のドデシルマルトシドで処理することによりチラコイド膜を可溶化し、かつ、測定時には希釈されることを利用し、その後のドデシルマルトシドによるP-700の失活などを最小限にする。
  4. 定量化をする際のベースラインの取り方は、スペクトルの形、ベースラインの傾きなどによって一概には言えない。一般的にはベースラインを書かせておいて、そこに酸化還元をさせた後のスペクトルを上書きして、700 nm付近の吸収変化量を求める。ベースラインが信用できない場合は、725 nmと690 nmをほぼ吸収変化がない点(isosbstic point)と仮定し、そこを結ぶ直線をベースラインとする方法もある。ただ、P-700のスペクトルの形状は生物種によって必ずしも同じではないので、isosbestic pointの選定などには注意を要する。

参考文献

  1. Sonoike K and Katoh S (1988) Biochim Biophys Acta 935: 61-71 (このプロトコールの測定方法)
  2. Sonoike K and Katoh S (1990) Plant Cell Physiol 31: 1079-1082 (P-700の差分子吸光係数)