低温クロロフィル蛍光スペクトル測定

光合成系に影響が見られる変異体の解析などにおいて、光化学系Iや光化学系IIの量を簡便にチェックしたい場合があります。そのような場合、きちんとそれぞれの光化学系量を定量することもできますが、相対的な量比でしたら、以下の低温クロロフィル蛍光スペクトルによって極めて簡単に測定することができます。光化学系の量比は植物の環境応答によっても変化しますから、そのような応答を解析する場合にも利用可能です。さらに、やはり植物の代表的な環境応答の一つであるステート遷移に関する情報も、この低温クロロフィル蛍光スペクトルにより得ることができます。ここでは、低温蛍光スペクトル測定の原理と、それによって光化学系量比とステート遷移に関する情報を得る方法を紹介します。

  1. 低温クロロフィル蛍光スペクトル測定の原理
  2. クロロフィル蛍光スペクトル測定による光化学系量比の推定
  3. クロロフィル蛍光スペクトル測定によるステート遷移の推定
  4. 通常の蛍光光度計による低温蛍光スペクトル測定

低温クロロフィル蛍光スペクトル測定の原理

クロロフィルは光を吸収して励起された場合、そのエネルギーの一部を再び光として放出します。これを蛍光といいます。酸素発生型の光合成生物は、クロロフィルを結合した2種類の複合体、光化学系Iと光化学系IIを持ち、どちらも特有の蛍光を出します。ただ、室温では光化学系Iの蛍光は弱く、また二つの光化学系の蛍光の波長が近いため、両者を区別することは通常できません。一方、液体窒素温度(-196℃、絶対温度77 K)まで冷却すると、光化学系Iのクロロフィルは715-735 nmに蛍光発光を示すのに対して、光化学系IIは685 nmと695 nmに蛍光発光を示します。つまり、蛍光スペクトルを測定すれば、2つの光化学系の相対的な比率を簡便に見積もることができます。また、各光化学系からの蛍光発光の強さは、その光化学系にエネルギーを渡すアンテナのサイズに比例します。従って、ステート遷移のように条件によって見かけのアンテナサイズが変化するような場合には、クロロフィル蛍光の強さに反映されることになります。従って、例えばステート1からステート2へのステート遷移が起こっているかどうかをクロロフィル蛍光によって推定することも可能です。

ただし、光化学系量比といってもその比率の絶対値が求まるわけではありません。光化学系Iと光化学系IIでは、クロロフィルあたり、もしくは反応中心あたりのクロロフィル蛍光の収率は異なりますから、それぞれの極大波長での蛍光の強度が1:1であっても、光化学系量比が1:1であることにはなりません。しかし、遺伝子の変異や環境への応答によりその量比が変動するような場合、その変動は蛍光強度のピーク強度比に反映されます。例えば系Iと系IIの蛍光強度の比が1:1から1:2に変化したら、おそらく相対的な光化学系II量が倍になった、という推定をすることはできます。ただ、この場合、光化学系II量が倍になったのか、光化学系I量が半分になったのかは区別できません。ステート遷移に関しては、下のステート遷移測定の項目をご覧下さい。

この他にクロロフィル蛍光スペクトルに影響を与える要因として、実は試料のクロロフィル濃度があります。試料のクロロフィル濃度が高いと、クロロフィルから発光した蛍光が試料から外へ出る前に別のクロロフィルによって吸収されてしまいます。これを自己吸収といいます。クロロフィルの赤色部の吸収波長は670-680 nm付近ですから、その影響は、光化学系IIの685 nmの蛍光の場合に一番大きく、次が695 nmの蛍光になり、光化学系Iの蛍光に対する影響は一番小さくなります。従って、クロロフィル濃度が高い試料では光化学系IIの蛍光が選択的に吸収され、見かけ上、光化学系IIが少なくなっているように見えます。従って、クロロフィル濃度が異なる試料間でスペクトルを比較することはできません。液体試料の場合は、5 μg/ml 以下のクロロフィル濃度にするとほぼクロロフィルの自己吸収の影響を避けることができます。クロロフィル蛍光スペクトルは、植物の葉でもそのまま測定できる点が利点なのですが、当然葉の場合は局所的なクロロフィル濃度が極めて高いので、スペクトルを見ると必ず光化学系Iのピークが相対的に非常に大きくなっています。ですから、緑の色が違うような葉の間でスペクトルを比較しても意味がない、という点に注意する必要があります。

研究室では、手作りの蛍光分光光度計によって測定を行なっています。一般的な蛍光光度計でも、液体窒素温度での測定を可能にするユニットを増設することにより測定が可能になります。その場合、試料セル自体を液体窒素に浸して温度を下げる場合と、試料セルの金属部分を一部液体窒素に浸して熱伝導によって温度を下げる場合の二通りがあります。前者の場合は、測定光の光路が液体窒素の中を通るため、特に熱の絶縁が不完全な場合、液体窒素の中の泡が測定を妨害する場合があります。また、後者の場合は、冷えた試料セルが空中にでているため、場合によっては霜が付いて測定を妨害する場合があります。そこで、研究室の装置においては、試料への励起光照射と蛍光の測定に石英の光ガイドを用い、この光ガイドを試料に密着させた上で、試料ごと液体窒素に浸すという工夫をしています。これにより、液体窒素の泡の問題や霜の問題は除去されることになります。分光器は蛍光を測定する側だけに用いているので、励起には光学フィルターを通した幅の広い光を使います。一般的な蛍光光度計による測定についてはこのページの一番下に通常の蛍光光度計による低温蛍光スペクトル測定として記載してあります。

クロロフィル蛍光スペクトル測定による光化学系量比の推定

装置:手作りの液体窒素温度における蛍光スペクトル測定装置、PC、魔法瓶容器、液体窒素

測定手順:

  1. 蛍光スペクトル測定装置の左側のPCを立ち上げ、正面のマイクロアンメーター(微小電流計)の電源を入れておく。また、励起光光源のフィルターが適切なものであるかどうかをチェックする(フィルターに関しては下のその他の注意点を参照)。
  2. 液体試料の場合は、クロロフィル濃度を 5 μg/ml に調整し、100 μl を真鍮の試料ホルダーに入れ、泡が入らないように石英ガラスの光ガイドを差し込む。葉の場合は、黒いビニールテープに葉を貼り付け、それを石英ガラスの光ガイドに直接貼り付ける。
  3. 試料部分を黒い布で覆い、10分間暗順応させる(測定時のステート状態を常に一定の状態にするため)。ステート遷移の測定に関しては次の項を参照すること。
  4. 液体窒素を魔法瓶に注ぎ、試料を石英ガラスの光ガイドごと液体窒素に浸し、凍らせ、魔法瓶を上から黒い布で覆い、外部からの光を遮断する。
  5. 奥の高電圧電源をオンにする。葉の測定では550 V程度、希薄試料の場合は700 V程度。外部の光を遮断せずに、高電圧電源をオンにすると光電子増倍管が壊れる可能性があるので注意する。
  6. 励起光をあてない状態でマイクロアンメーターの針の位置を確認する。蛍光が強いと針が左に振れるようになっているので、マイクロアンメーターの0点調整つまみを使って右側から1/5ぐらいのところになるようにするのがよい。ただし、あまり右側ぎりぎりだと、針自体は振り切れていなくとも実際の出力が振り切れていることがある。
  7. 温度が十分に下がるまで(約30秒)おいた後、励起光光源ををオンにする。
  8. モノクロメーターをmanualにし、650 nm から 750 nm ぐらいの間を動かしてみて、電流計の針が動くこと、また振り切れないことを確認する。針が振り切れたり、ほとんど動かない場合は、マイクロアンメーターのレンジを適宜調整する。場合によっては、高電圧電源の電圧を調整してもよい。高電圧電源の電圧とマイクロアンメーターのレンジは必ず記録すること。波長を動かす際に、モノクロメータの波長範囲を短波長(600 nm以下)にすると光電子増倍管が壊れる可能性があるので注意すること。
  9. 次に波長を645 nmに設定する。この状態で約2~3分待つ(シグナルを安定させるため)。
  10. 分光器のScanning speedをFlu at 77Kにし、進行方向をNormalにし、パソコンのFluorescence folderの下の方にあるデータ取り込みプログラムFl_input.exeを起動する。
  11. モノクロメーターの波長送りをオンにし、波長が650 nmに到達した瞬間にPCのスペースキーを押す。
  12. 波長が770 nmを超えたら、モノクロメーターの波長送りをオフにする。この際に、波長が770 nmに来た瞬間に、プログラムの方でファイル名入力画面になることを確認することが望ましい。たまに、タイミングがずれていることがあり、その場合には、蛍光ピークの位置が見かけ上ずれてしまう。
  13. 高電圧電源のスイッチを切り、励起光をオフにし、最後に試料を液体窒素から取りだし、室温に放置する。
  14. Fl_input.exeの画面で測定ファイル名を打ち込むと、そのファイル名でデータがセーブされる。

バックグラウンドの補正

上記の測定では単にマイクロアンメーターの出力をAD変換して手作りのプログラムで取り込んでいるだけなので、蛍光が0の点がどこかもわからない。また、蛍光が大きいほどマイナスに大きくなる数値がファイルに書き込まれる。そこで、暗所で一度測定を行ない、そこからデータを引き算し、波長と蛍光強度を対応させた形でファイルに書き込むプログラムFL_convB.exeを用意してある。

  1. 励起光がオフの状態で上記の測定を繰り返す。
  2. Fl_input.exeの画面で暗所の測定ファイル名を打ち込み、バックグラウンドのファイルを作る。
  3. Fluorescence folderのFl_convB.exeを開き、測定ファイル名を打ち込み、次に暗所の測定ファイル名を打ち込み、最後に保存ファイ名を打ち込む。この操作によって、暗所のベースラインが引き算され、データが波長と蛍光強度が対応した形に変換された数値が保存ファイルに保存される。

暗所での測定をベースラインにする代わりに、水を試料として励起光をつけて測定したデータをバックグラウンドとして取ることも可能である。この方が、迷光などがある場合は、より正確なスペクトルが得られる。しかし、試料を取り替えて測定する必要があるので、通常は、試料をそのままで暗所で測定したものをバックグラウンドとしてる。バックグラウンドは、高電圧電源の電圧、マイクロアンメーターのレンジ、マイクロアンメーターの0点調整つまみを動かしていない場合には、複数の測定に共通して使うことができる。レンジなどを変えた場合は取り直す必要がある。

その他の注意点

  1. シアノバクテリアの場合、685 nmの蛍光は、系IIのクロロフィル蛍光の他にフィコビリンの蛍光の寄与もあるので、695 nmの蛍光強度の値を光化学系IIの蛍光の値(F695)、725 nmの蛍光強度の値を光化学系Iの蛍光の値(F725)として、F725/F695を光化学系I / 光化学系II の比の指標としている。実際にはそれぞれのピーク波長を用いる。
  2. 高等植物の場合は、695 nmの蛍光が比較的不安定な場合があるので、むしろ、685 nmの蛍光強度の値を光化学系IIの蛍光の値(F685)、735 nmの蛍光強度の値を光化学系Iの蛍光の値(F735)として、F735/F685を光化学系I / 光化学系II の比の指標としたほうがよいかも知れない。実際にはそれぞれのピーク波長を用いる。
  3. 励起光としては、通常Corningのバンドパスフィルター(CS 4-96)を通した幅の広い青色光を用いる。クロロフィル励起の場合は、これに日本真空工学のダイクロイックフィルター(DFブルー)をさらに通す。フィコビリン励起の場合は、東芝のカットオフフィルター(Y-46)に日本真空工学のダイクロイックフィルター(DFシアン)を重ねて通した黄色光を使う。
  4. くれぐれも光電子増倍管に強い光を入れないこと。光が入る可能性がある時(サンプル交換など)には、必ず高電圧電源がオフになっていることを確かめること。光電子増倍管は1本30万円ぐらいする。

クロロフィル蛍光スペクトル測定によるステート遷移の推定

ステート遷移の場合は、何か定量化することができるわけではありません。シアノバクテリアは原核生物であるため、細胞内の光合成電子伝達系が呼吸鎖と一部を共有されています。従って、高等植物とは異なり、暗所に細胞をおいておくとプラストキノンプールは還元されてステート2の状態になります。一方で、光化学系IIの阻害剤であるDCMUを加えて光を照射すれば、光化学系Iの働きでプラストキノンプールは酸化されてステート1の状態になります。このようにして、細胞を簡単にステート1もしくはステート2の状態にすることができますから、2つの状態で低温クロロフィル蛍光スペクトルを比較すれば、ステート遷移を観察することができます。ステート2では光化学系IIのアンテナサイズが小さくなっているはずですから、相対的に光化学系IIの蛍光は弱くなり、逆にステート1では光化学系IIの蛍光が強くなるはずです。従って、2つの状態でクロロフィル蛍光スペクトルに差があればステート遷移をしている、差がなければステート遷移に異常がある、と結論できます。これによってステート遷移を推定する方法を以下に示します。基本的に、細胞の前処理が違うだけなので、測定手順などは全く上の場合と一緒です。

細胞の前処理:

  1. ステート2における測定の場合は、細胞を真鍮の試料ホルダーに入れた後、暗所において10分程度室温で放置する。その後、上記のような測定手順を踏む。
  2. ステート1における測定の場合は、細胞に最終濃度10 μM のDCMUを加えてから、真鍮の試料ホルダーに入れ、励起光を1分程度照射して、そのまま光をあてながら液体窒素に入れて凍らせる。その後、上記のような測定手順を踏む。

このようにして、異なる前処理をした場合に光化学系Iと光化学系IIの蛍光の強度比が変化した場合は、ステート遷移の能力があると判断できます。この方法は、高等植物の場合にも、ステート1とステート2を光化学系IIに多いクロロフィルbを励起する光と光化学系Iを選択的に励起する赤外光を用いれば適用できるはずですが、実際にやったことはありません。

通常の蛍光光度計による低温蛍光スペクトル測定

装置:蛍光光度計FP-8500に液体窒素による冷却ユニットPMU-830をつけ、850 nmまで波長拡張したもの(日本分光)

通常の蛍光光度計は室温での測定のみ対応していますので、オプションで液体窒素温度まで試料を冷却するユニットをつける必要があります。また、系1のクロロフィルの低温蛍光バンドの極大は735 nm付近まで来ますから、測定波長としては800 nm付近まで測定できることが必要となります。したがって測定波長範囲が狭い機種の場合は、波長拡張を行う必要があります。さらに一般的な低温冷却ユニットは固体試料を前提としている場合が多く、普通の石英チューブ型のセルでは凍結時にかなりの確率で破損が生じます。したがって、試料セルを特注するか、あるいは適当な大きさのプラスチック製チューブなどを試料容器として用意する必要があります。

開始・終了手順:

  1. 蛍光光度計左側面のメインスイッチをオンにする(上面右手前のボタンではない)。
  2. 制御用のパソコンをオンにし、測定ソフトを立ち上げる(これは、蛍光光度計が立ち上がった後にする)。
  3. 測定(次項)
  4. 測定ソフトを終了する。終了するとドライバーが停止するので、それを確認してから蛍光光度計本体のスイッチをオフにする。

測定手順

  1. メインプログラムから「スペクトル測定」をダブルクリックして測定モードに入る。
  2. 測定ツールバー上の「パラメータ」をクリックし、測定モードなどを選択する。通常は測定モードは「蛍光」あるいは「励起」を目的に応じて選択し、励起バンド幅、蛍光バンド幅、レスポンス、感度、蛍光(励起)波長、開始波長、終了波長を設定する(次項)。
  3. 試料を入れる前に、制御ツールバー上の「オートゼロ」をクリックし、蛍光強度を0に設定する。
  4. 試料をセットし、測定ツールバー上の「試料測定」をクリックし、測定を行う。測定が終了すると自動的にスペクトル解析プログラムが立ち上がり、ここからファイルへの保存やテキストファイルへのエクスポートによりデータを記録できる。
  5. 以上は、ツールバー上のアイコンを使わず、メニューの「測定」あるいは「制御」からでも行うことができる。

パラメータの設定

  1. 基本タブのバンド幅は目的の蛍光発光のバンドの幅に合わせて決定する。低温クロロフィル蛍光測定で685 nmと695 nmのバンドをきちんと分けたいときには蛍光バンド幅は2 nm以下にしたほうがよい。励起バンド幅は、通常の発光スペクトルをとるためだけなら広くても構わない。
  2. 基本タブのレスポンスは走査速度との兼ね合いで決定する。
  3. 基本タブの感度は蛍光のIntensityが10000を超えない程度に設定する。
  4. 制御タブのスペクトル補正はoff。通常のローダミンによる補正は、長波長領域の蛍光を測定するクロロフィル蛍光の測定の場合は使えない。必要ならば、標準光源によりちゃんと補正する必要がある。別の方法として、励起波長と蛍光波長を同期させることによりフォトマルの感度については、情報を得ることができる。減光板と散乱板を入れて同期モードで測定したスペクトルで、実際の測定スペクトルを割り算すれば、フォトマルの感度補正をすることはできる。
  5. 光により分解されやすい資料の場合、制御タブから、測定時にのみ励起光のシャッターを開くように設定できる。
  6. 情報タブから、試料や測定条件の情報を入力することができる。また、ここで、それらの情報の入力ダイアログを測定終了後に開くかどうかを設定できる。
  7. データタブの転送設定をオンにしておくことにより、自動的にスペクトル解析プログラムが立ち上がる。

試料室の交換

低温冷却ユニットは、通常の試料室を取り外して付け替える形で本体に装着します。以下にその方法を。

  1. 通常の試料室の下部手前の下側につきだしている2本のねじを手で緩めてはずす。
  2. 試料室を手前に少し持ち上げるように引き出して取り出す。
  3. 低温冷却ユニットを手前から滑らせて入れる。この際に、ユニット底部の奥の切れ込みが、本体の対応部のねじの下側に入るようにする(ねじの上にのってしまうと光軸がずれる)。
  4. ユニットがカチッとはまったことを確認してユニット下部の2本のねじを手で締める。
  5. なお、以上の操作をもし本体スイッチをオンにしたままで行う場合は、励起光および測定光のシャッターを閉じておく。