植物生理生化学特論 第６回講義
続・発光測定の方法、植物の低温感受性
第６回の講義では、前回の続きとしてFRETなどの蛍光発光測定の原理について解説したのち、植物の低温ストレス応答の研究例の紹介をしました。
Ｑ：今回の講義で1番興味を持ったFRETについて考察してみた。これは、ある物質Xとある物質YにそれぞれECFPとEGFPが接触しており、ECFPの励起光を当てることによりECFPの蛍光が発せられ、その蛍光をもとにしてEGFPが励起せれEGFP蛍光が見られ、XとYの相互作用があるかの確認ができる仕組みである。そこで1つ思いついたことは、蛍光から蛍光ではなく、発光により色素が励起状態になり蛍光を発するものである。これにより、生体内の自然な現象のリズムや1細胞での観察が発光よりさらに強い光の蛍光で鮮明に観察できるのではないかと考えた。これによるメリットは励起光の光源を気にする必要がないため測定方法が限られないことである。このような技術が無いか調べたところ、産総研のHPで「自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発」というものを見つけた。やはり既に考えられていた。これによると今後の予定として「我々は、本研究においてBAFがルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質との組合せにより、将来、より明るい生物発光プローブとして更に改善できる可能性を示した。今後、BAF自体の更なる改良と高効率BRETが起こる分子機構の解明を目指すとともに、細胞内で起こる現象を高精度且つリアルタイムにモニタ可能な生物発光イメージングシステムを目指す。また、簡便な検査試薬としての可能性も追求したい。」と書いてある。より明るい生物発光プローブとしてEYFPのミュータント株であるVenusを使用すればより明るい鮮明な蛍光が見られるのではないかと思う。
Ａ：これだと、結局、産総研のHPのロジックに従っていることになって、自分のアイデアという感じがしません。たとえすでに考えられていたとしても、それをきっかけに少しでも自分の論理を構築して見てください。
Ｑ：今回は動物と植物の環境応答について記述する。講義では動物の恒常性や植物の低温適応を移動能力により説明していたが、移動能力の低い動物もいるし、逆に自身は移動できなくても植物は胞子や種子によって環境を選択することもできる。そのような場合はどうだろうか。特に動物に着目して考える。極地の湖に住む魚類などは氷点下の環境において、細胞の組成を変化させることで凍結せずに生存し、あるいは恒常性をよく持つ哺乳類も冬眠を行うが、冬眠中は生理学的にかなり異なると言われている。前者は凍結耐性の獲得を目的とするが、後者はどちらかといえばChilingに対する植物の耐性獲得に近い。というのも哺乳類の冬眠時は体温が下がるものの０℃以下にはならないことが多い。逆に問題となるのは例えば心筋におけるCaイオンチャネルの機能低下であり、この問題に対してイオンチャネルを閉じ、内部でCaイオンを循環させることで対応している。しかし複雑でありながら、熊からリスまで様々な異なる系統の動物に、しかも水平伝播の難しそうな哺乳類に類似した機能が実装された、という事実は興味深い(未だ冬眠については解明が進んでおらず、詳細な機能について類似性が言えるわけではないが)。考えるに、低温に対する問題が多くの動物に共通しており、またその解決方法がそれほど多くなかったため、必然的に類似した機能を実装した生物が繁栄したのではないだろうか。
参考文献：N.Kondo, S.Shibata 1984 Science Vol225 641-643
Ａ：しっかりと論理が展開されていて良いと思います。最後の収斂進化という仮説は、独創性がある感じはしませんが、どうしてもそのようなアイデアに落ち着くのかもしれません。
Ｑ：植物の低温ストレス感受性の有無について考察します。チラコイド膜を単離し弱光を照射したとき、低温耐性植物であっても低温感受性植物と同様、系Ⅰが阻害されるということから、普段はチラコイド膜以外の何かの働きによって系Ⅰが保護されています。(*1) また、光化学系の反応は温度依存性がほぼゼロであり、かつ炭酸同化系の酵素反応はQ10=約2.0であることを考えると、低温耐性植物は葉では酵素反応を助けるような反応が生じ、チラコイド膜を守っていると考えられます。このとき、物理的にチラコイド膜以外の組織がチラコイド膜を包んでいることが低温耐性の理由ともとれますが、低温感受性植物の葉の薄さを測らないことにはこの仮説を検証することはできません。一方で、ホウレンソウ（低温耐性）は寒冷な気候を好み、キュウリ（低温感受性）は温暖な気候を好みます。つまり、ホウレンソウは低温耐性を持っていたからこそ寒冷気候で繁栄し、キュウリは持っていなかったからこそ温暖気候で繁栄すると考えられます。したがって、低温感受性植物と低温耐性植物の違いとは、低温に対応する機能が遺伝子にコードされているかいないかであると結論付けることができます。ただし、キュウリ以外の温暖適応植物が低温感受性を持つ、という仮説を確かめなければなりません。
(*1)http://www.photosynthesis.jp/PlantResponse.html
Ａ：やや論理的な統一性に欠ける気がします。最初は反応の温度依存性の違いから議論が出発していますが、それと物理的な保護機構のつながりがわかりません。さらに、「一方」の前と後のロジックがつながっているのかどうかも判断できません。あれこれ思いつくことを書くのではなく、なるべく一つの一貫した論理を構築するように努力してください。
Ｑ：今回の講義では先生が低温ストレスによる光合成阻害の原因を探っていった話の中で、研究を行う上で重要な論理的思考とその実践について具体例とともに知ることができ良かったです。とくに考えさせられたのが、先生が研究を始める以前に出ていた、数々の低温での光合成阻害に関する論文が、それぞれに違う部位の阻害をその原因として提唱していた、というところです。ある現象において、何がその原因で何がその結果であるかをきちんと突き詰めて考えることは、研究をするにあたって最も重要なことというか、目的そのものに近いと思います。しかし、原因と結果は実験法によっては時に同時に起こっているようにも見えがちなため、それを逆にとらえてしまうことが多々起こりうるのではないかと思いました。また、Ａという現象の結果としてB,C,Dなど複数の事象が起こるとき、結果であるところの事象同士、例えば互いには直接の関係を持たないBとCを、「原因」と「結果」の関係として誤ってとらえてしまうことにも注意しなければならないと感じました。こういった取り違えがプロの研究者であっても多くあるのですから、私たち学生が研究を行うにあたってはさらに注意が必要でしょう。当たり前のことですが、ある現象について研究する場合、その「原因」と「結果」というのは、きちんと納得のいく「過程」とともに機構の中に位置づけられて初めて意味を持つのだと私は考えます。現象の原因の解明は研究の目的ですが、原因の予想ができただけでは研究の入り口に立った程度であると考えたほうが良いのだと思いました。
Ａ：きちんと書けてはいますが、レポートとしては何か物足りない感じですね。全体としてもっともなことが書いてあるせいかもしれません。もう少し、独自のアイデアが欲しい所です。
Ｑ：今回の講義では、低温ストレスにさらされた植物の鉄硫黄クラスターFX, FA, FBが破壊されるという内容が扱われた。本レポートでは、これら鉄硫黄クラスター部位(以下単に鉄硫黄クラスターという場合はFX, FA, FB部位を指す)が破壊される理由を考察する。電子を受け取った鉄硫黄クラスターは強力な還元剤であり、フェレドキシンと反応できない場合は他の様々な物質と反応して分子が壊れてしまうと推測される。よって、鉄硫黄クラスターが破壊される原因は、電子をフェレドキシン(及びその下流)に流せないことである。講義で扱われたように、低温条件下では炭素同化系を始め様々な酵素反応の速度が遅くなる。同化反応の速度が遅くなると、光化学反応が進むにつれて細胞内のNADP+/NADPH比が低くなっていき、フェレドキシンから下流に電子を流せなくなっていく。よって、鉄硫黄クラスターはフェレドキシンを還元できなくなり、壊れてしまう。低温ストレスにさらされた際に、他の部位ではなく真っ先に鉄硫黄クラスターの部位が破壊されるのは、鉄硫黄クラスターが壊れるまでの間は電子伝達を行えるので、他の部位は損傷をまぬがれているのだろう。鉄硫黄クラスターが破壊された後は、酸化剤・還元剤としての反応性が高い部位から損傷していくので、実験条件が異なる過去の論文では低温障害部位がさまざまに報告されていたのかもしれない。
参考文献：東京大学光合成教育研究会編、 「光合成の科学」初版、東京大学出版会、2007
Ａ：よく書けていると思いますが、「還元剤だから・・・他の様々な物質と反応して分子が壊れてしまう」という部分がやや弱いように思いました。還元剤が反応するとしたら酸化剤とでしょう。生物の体というのは、ある意味で還元的な物質でできている場合が多いので、そのあたりの議論があると完璧ですね。
Ｑ：今回の講義では、光感受性の低温ストレスにおける研究例について教わった。そこでは、PSIにおいてストレスによりAoから下流の電子受容体が失活したことから、電子スピン共鳴・Western blottingを用いた実験を行っていた。レポートではこの結果について更に考えられることについて述べる。一つ目に、電子スピン共鳴によってFA/FBとFxが破壊されたことが分かっている。しかしWestern blotting分析によりPsaBの分解産物が検出されたことから、PsaBに結合しているクロロフィルAo・フィロキノンA1も破壊されていることが考えられる。二つ目に、本講義では分析されたタンパク質についてはPsaA・PsaBの2つが取り扱われた。しかし電子スピン共鳴によってFA/FBとFxが破壊されたことから、これらの電子受容体の結合する、ストロマ側の表在性サブユニットPsaCについても分解産物が検出される可能性が高いことが考えられる。よってAoから下流では、ある特定の電子受容体が破壊されたと言うよりは、総合的に受容体が失活していることが考えられる。
参考：光化学系I反応中心の鉄-硫黄クラスター、大岡 宏造、北海道大学低温科学研究所
Ａ：これは、簡潔に要領よくまとまっていますね。しいて言うとすると、系Iの活性は半分以上落ちるような条件でも、PsaBの分解産物のバンドは、もとのバンドの濃さと比べると非常に薄かったと思います。そのあたり、定量性についてはもう少し考慮する余地があるかもしれません。